作者：马丽，白燕，刘仲明，刘芳

近几年来ＤＮＡ电化学传感器在临床检测中的应用受到了广泛关注。Ｗａｎｇ等用阳极氧化法,将与结核杆菌基因ＤＲ区相对应的两个长度分别为２７ｂｐ和３６ｂｐ的ＤＮＡ探针,固定在碳糊电极表面,制成ＤＮＡ电化学传感器,利用计时电位分析法,以３３＋Ｃｏ（Ｐｈｅｎ）作指示剂,进行了ＤＮＡ传感器用于结合杆菌诊断的初探。Ｈａｓｈｉｍｏｒｏ等将一个２０聚体的核苷酸一端修饰上—ＳＨ,再通过—ＳＨ在金表面进行探针修饰,检测了ＰＶＭ６２３的ＰａｒｔⅠ片断上的致癌基因Ｖ＿ｍｙｃ。我们利用巯基与基底材料的强烈化学结合和聚亚甲基链的定向排列］,采取自组装硫醇单分子膜技术研究了ＤＮＡ电化学传感器的制备方法。并考察了ＤＮＡ电化学传感器对血清样品中乙肝病毒(ＨＢＶ)ＤＮＡ的响应,通过与荧光聚合酶链反应（ＰＣＲ）法的比较,初步探索了将该法应用于临床检测的可行性。

１实验部分

１．１材料与仪器

１．１．１试剂
　　
Ｐｉｒａｎｈａ溶液:９８%（φ）浓硫酸-３０%（φ）双氧水(体积比３∶１);ＤＮＡ固定液:１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ(ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３)-ＨＣｌ-１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液,称取Ｔｒｉｓ碱０．１２１１ｇ，ＥＤＴＡ０．０３７２２ｇ，溶于９０ｍＬ双蒸水中,用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调节ｐＨ至８．０，然后定容至１００ｍＬ(ＴＥ缓冲液);ＤＮＡ杂交液:０．３ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ-０．０３ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸三钠Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ•２Ｈ２Ｏ缓冲液,ｐＨ８．０(２＿ＳＳＣ缓冲液);杂交指示剂:Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｃ２５Ｈ２４Ｎ６Ｏ•３ＨＣｌ）;杂交指示剂测试底液:０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液,ｐＨ７．４;电极淋洗液:１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液,称取Ｔｒｉｓ碱０．９６９２ｇ，ＥＤＴＡ３．８７６０ｇ，溶于７５０ｍＬ双蒸水中,用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调节ｐＨ至８．０，然后定容至８００ｍＬ;其它试剂均为分析纯;实验用水均为二次蒸馏水;ＤＮＡ提取液１、ＤＮＡ提取液２,由深圳市匹基生物工程有限公司提供。

１．１． ２单链ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)及血液样品
　　
５＇＿ＨＳ（ＣＨ２）６—ＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＴ＿３＇单链ＤＮＡ,由上海生工生物工程技术公司合成,其中ＨＳ（ＣＨ２）６为巯己基标记。１０份血液样品由广州军区总医院检验科提供,其中３份经过荧光ＰＣＲ标记法检测证明为不含乙肝病毒的正常人血液样品(即样品拷贝数小于４０)。

１．１． ３仪器
　　
ＣＨＩ８０２电化学分析仪(上海辰华仪器公司);高纯氮;ＤＬ＿６０型超声波清洗器;金圆盘电极,内径５ｍｍ(上海辰华仪器公司)。实验采用三电极体系,Ａｇ／ＡｇＣｌ电极为参比电极,铂电极为对电极,金圆盘电极为工作电极。

１．２单链ＤＮＡ修饰金电极的制备

１．２．１电极的预处理
　　
金电极经Ｐｉｒａｎｈａ溶液、丙酮、无水乙醇依次浸泡０．５ｍｉｎ,然后用０．０５μｍＡｌ２Ｏ３磨垫抛光,超声波清洗约１ｍｉｎ,氮气干燥。
１．２． ２单链ＤＮＡ在金电极表面的自组装
　　将金电极浸入含有１００ｍｇ／ＬＨＳ—ｓｓＤＮＡ（Ｓ０）的ＴＥ缓冲液中,于４℃放置１２ｈ,得到单链ＤＮＡ修饰电极(ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ电极)。依次用１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液(ｐＨ８．０)、二次蒸馏水淋洗电极表面以去除未组装的ＤＮＡ。

１．３． ３指示剂与单链ＤＮＡ修饰金电极的结合
　　
将ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ电极浸入含有１００μｍｏｌ／ＬＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８的１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液(ｐＨ８．０)中,暗处放置５ｍｉｎ。电极取出后,用１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液(ｐＨ８．０)、二次蒸馏水反复淋洗电极表面以去除由于静电作用而吸附在电极表面的杂交指示剂。

１．３双链ＤＮＡ修饰金电极的制备

１．３．１血清样品预处理
　　
取待测血清１００μＬ加入到０．５ｍＬ离心管中,加入１００μＬＤＮＡ提取液１,振荡混匀,１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ,吸弃上清液;再加入２５μＬＤＮＡ提取液２,振荡１０ｓ(沉淀无需打散混匀),２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｓ,在１００℃沸水浴放置１０ｍｉｎ,１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ,保留上清液用于双链ＤＮＡ修饰电极的制备。如果本裂解产物当天不使用,则要保存在-２０℃,使用前室温解冻,１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。

1.3.２ＤＮＡ的杂交反应
　　
取上述制备好的血清样品２０μＬ置于杂交容器中,用２＿ＳＳＣ缓冲液稀释至１００μＬ,在水浴中９９℃变性处理５ｍｉｎ。变性完成后,立即转入０℃冰水浴中以防止ＤＮＡ恢复双螺旋结构,并将按前述方法制备好的ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ修饰电极浸入变性后的血样中,室温下杂交９０ｍｉｎ,得到互补双链ＤＮＡ修饰金电极（ｄｓＤＮＡ＿Ａｕ电极）。然后依次用１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液(ｐＨ８．０)、二次蒸馏水淋洗电极表面。１．３．３指示剂在双链ＤＮＡ修饰金电极上的嵌入将ｄｓＤＮＡ＿Ａｕ电极浸入含有１００μｍｏｌ／ＬＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８的１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液(ｐＨ８．０)中,暗处放置５ｍｉｎ。电极取出后,用１０ｍｍｏｌＴｒｉｓ-ＨＣｌ-０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液(ｐＨ８．０)、二次蒸馏水反复淋洗电极表面以去除由于静电作用而吸附在电极表面的杂交指示剂。

１． ４电化学检测
　　
采用线性伏安扫描法,以０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液(ｐＨ７．４)为底液,扫描速度为１００ｍＶ／ｓ，在０．１～０．７Ｖ的电位范围内,分别测量指示剂在ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ电极和ｄｓＤＮＡ＿Ａｕ电极上的伏安信号。

２结果与讨论

２． １指示剂在ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ及ｄｓＤＮＡ＿Ａｕ电极上的伏安信号
　　
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８作为一种电活性染料,在金电极上可以在较低的电位下(０．５５Ｖ左右)产生一个不可逆的氧化峰电流,且电流密度较高(１００μｍｏｌ／Ｌ时可达到１．４ｍＡ／ｃｍ２)。对于裸电极,指示剂由于物理吸附而产生微弱的信号;对于单链ＤＮＡ修饰电极,指示剂与ｓｓＤＮＡ之间的化学结合作用使其产生氧化峰信号;对于双链ＤＮＡ,指示剂可以嵌入到双链ＤＮＡ形成的双螺旋结构的碱基对中,在电极表面形成ｄｓＤＮＡ-Ｈｏｅｃｈｓｔ层,从而产生较强的氧化峰信号。对上述几种情况,指示剂的氧化峰电流响应值大小如图１所示。



３． ２传感器的特异性与重复性
　　
将制备好的ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ电极分别与１ｍｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ两种质量浓度的互补ＤＮＡ溶液和单碱基错配的ＤＮＡ溶液作用。结果表明,当单碱基错配ＤＮＡ溶液质量浓度（１ｍｇ／Ｌ）为互补ＤＮＡ质量浓度（１０μｇ／Ｌ）的１００倍时,所得到的指示剂响应信号(０．０２６μＡ)大约为互补ＤＮＡ溶液信号(０．０５２μＡ)的５０%。故在一定质量浓度范围内,电化学ＤＮＡ传感器能够较好地区分互补ＤＮＡ序列和单碱基错配的ＤＮＡ序列。用制得的１０支电化学ＤＮＡ传感器对拷贝（ｃｏｐｉｅｓ）数为４．９８×１０６的血清样品进行１０次检验,所得结果如表１。由表１可以看出,在对血清样品的检验中,电化学ＤＮＡ传感器有着良好的重复性。

２． ３传感器的线性范围与检出限



实验证明,在０．０５～１ｍｇ／Ｌ范围内时,不同质量浓度(ｙ)的互补ＤＮＡ与修饰电极杂交前后指示剂峰电流响应值之差(ΔＩｐ／μＡ)呈线性关系。其线性回归方程为ｙ＝１．１３８９ΔＩｐ+０．１７９１(ｒ２＝０．９９５５)。互补链质量浓度低于１０μｇ／Ｌ时,虽然能够观察到指示剂在ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ和ｄｓＤＮＡ＿Ａｕ电极上的伏安信号,但如果有单碱基错配ＤＮＡ存在,可能会造成较大误差。当互补链质量浓度在１μｇ／Ｌ时,指示剂在ＨＳ—ｓｓＤＮＡ＿Ａｕ和ｄｓＤＮＡ＿Ａｕ电极上的ΔＩｐ接近于３倍的标准偏差０．０５１μＡ,该质量浓度视为检出限。



３． ４电化学ＤＮＡ传感器法与荧光ＰＣＲ法对血清样品检测结果对比
　　
电化学ＤＮＡ传感器法与荧光ＰＣＲ法对血清样品检测结果对比见表２。对于ＰＣＲ阳性者,ＤＮＡ电化学传感器均能检出,且荧光ＰＣＲ分析结果中拷贝数越高的,在传感器分析结果中其ΔＩｐ值越大。而对于正常人的血样,用传感器法观察到指示剂的电流响应比阳性样品小得多,低于检出限信号(ΔＩｐ＜０．０５１μＡ)。由此说明,ＤＮＡ电化学传感器可以检出血清中的乙肝病毒。从本实验可以看出,ＤＮＡ电化学传感器法具有较好的特异性、重复性,且不需ＰＣＲ扩增,避免了由于ＰＣＲ扩增污染而导致的假阳性结果。同时有利于进行集成化,实现多基因同步检测的目的。因此,电化学ＤＮＡ传感器应用前景广阔,具有临床推广价值。

来源：中国电化学网