刘长春,崔大付(中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室,北京100080)

电化学传感器是指能感应(或响应)生物、化学量,并按一定规律将其转换成电信号输出的器件或装置,它一直是分析科学中一个非常活跃的研究前沿。而芯片实验室(ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ,ＬＯＣ)是指通过微细加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析单元和系统,以实现对无机离子、有机物质、蛋白质、核酸以及其它生化组分的准确、快速和大信息量的检测。它是近年来在微电子技术、生物技术、化学技术等多学科交叉的基础上发展起来的一种新型生化检测技术。实质上讲,芯片实验室就是一种微型化了的生化分析仪器,芯片实验室发展的最终目标是实现生化样品的微全分析,即把样品处理、生化反应和结果检测等三个典型的步骤全部集成在微芯片上完成,实现分析实验室的个性化和家用化。目前,芯片实验室主要有三种检测模式:激光诱导荧光检测(ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ,ＬＩＦ)、质谱检测(ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ,ＭＳ)和电化学检测(ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ,ＥＣ)等,激光诱导荧光检测尽管灵敏度很高,但检测设备价格昂贵,而且体积庞大,与微尺寸的芯片实验室相比极不匹配;质谱检测的瓶颈在于质谱仪与芯片实验室的接口问题,所以目前它主要用在对物质结构分析要求比较高的领域;而电化学传感器具有灵敏度高、选择性好、成本低、易微型化、样品消耗少、不受光程和样品浑浊度影响等优点,特别是其制作工艺与目前的ＭＥＭＳ技术兼容,非常适宜批量生产,可大大降低生产成本。通常被检测的生物、化学量可通过不同的方法转变成电信号,根据转变方式和输出的电信号不同,可以把电化学传感器分为电流型、电导型和电位型等三种类型。

1　电化学传感器的原理及其在芯片实验室中的应用

1.1　电流型电化学传感器

当在两电极间施加一定的外加电压时,被检测的电活性物质在电极表面就会发生氧化还原反应,产生一定的氧化还原电流,此电流的大小在一定范围内与待测物质的量呈线性关系。电流型电化学传感器选择性的好坏常取决于工作电极所选用的材料以及检测所施加的电压,用于制作工作电极的材料有很多,如铂、金、碳糊、碳纤维等,其中每一种材料都有各自的优缺点,具体选择哪一种材料视测定对象而定。电流型电化学传感器是三种电化学传感器中最易实现、研究最多和应用最广的一种,它为微尺寸范围内电活性物质的测定提供了一种高灵敏度的方法。现在,它已经被广泛应用于核酸片段、神经递质、人体代谢产物、氨基酸、多肽、糖、炸药、有机污染物等组分的分析。

Ｍａｔｈｉｅｓ领导的研究小组首次报道了利用标准的光刻技术在玻璃电泳芯片出口处制作Ｐｔ工作电极和对电极,他们用该芯片对多巴胺、肾上腺素和儿茶酚三种物质进行电泳分离和电化学检测,检测限分别为3.7×10-6,6.5×10-6,12×10-6ｍｏｌ/Ｌ。此外,他们还通过向ＤＮＡ溶液中加入嵌入式电活性物质,对ＤＮＡ限制性片段和沙门氏菌的ＰＣＲ扩增产物进行间接的电化学检测,实验证明该芯片实验室具有优良的分离效率和ｐｍｏｌ级的检测灵敏度。特别是在微芯片上成功地完成了ＤＮＡ片段的电化学检测,这为基因芯片检测器和基因传感器的进一步集成化和微型化提供了一条崭新的思路。Ｗａｎｇ领导的研究小组对电流型传感器在芯片实验室中的应用做了大量的工作,并对其进行了非常系统的研究。他们首先报道在玻璃微芯片毛细管的出口端喷镀了一层200ｎｍ厚的金作为工作电极,利用该芯片实现了多巴胺和异丙基肾上腺素的电化学检测,其检测限分别达到了1.0×10-6ｍｏｌ/Ｌ和1.3×10-6ｍｏｌ/Ｌ,多巴胺的检测范围为2.0×10-5～2.0×10-4ｍｏｌ/Ｌ。测定血糖的含量对准确诊断糖尿病和各种代谢紊乱都是不可缺少的化验项目,电化学生物传感器商品化最成功的一个例子就是葡萄糖传感器。事实上,许多电化学检测过程都可以转移到芯片实验室上完成。Ｗａｎｇ等人构建了一套柱前生化反应、柱中电泳分离和柱后电化学检测的芯片实验室分析平台,实验时,首先让样品溶液中的葡萄糖与葡萄糖氧化酶在入柱前发生衍生化反应生成具有电活性的Ｈ2Ｏ2,接下来生成的Ｈ2Ｏ2与尿酸、抗坏血酸在微毛细管柱中进行电泳分离,最后在电泳柱末端丝网印刷碳电极分别对它们进行电化学响应,从而实现的对尿酸、抗坏血酸的直接电化学检测和葡萄糖的间接电化学检测,尿酸和抗坏血酸的检测限为5.0×10-6ｍｏｌ/Ｌ,葡萄糖的检测限为6.0×10-6ｍｏｌ/Ｌ。同样采用丝网印刷碳电极作为工作电极,Ｗａｎｇ等人还首先报道了一种基于两种酶同时柱前衍生化的葡萄糖/乙醇芯片实验室,葡萄糖和乙醇分别与葡萄糖氧化酶、乙醇脱氢酶在入柱前发生酶催化反应生成Ｈ2Ｏ2和ＮＡＤＨ,在柱端碳电极分别对这两种具有电活性的酶反应产物进行检测,葡萄糖和乙醇的检测限的结果分别为1.0×10-5ｍｏｌ/Ｌ和5×10-4ｍｏｌ/Ｌ。以上两种芯片实验室既有效地利用了电化学检测的高灵敏度又充分发挥了酶反应的特异性和高效性,基于这一理念设计的芯片实验室,在床边检测(ｐｏｉｎｔｏｆｃａｒｅｔｅｓｔ,ＰＯＣＴ)芯片的开发方面具有极高的应用价值。曾勇等人自行搭建一套基于微电极的芯片毛细管电泳电化学检测系统,他们采用碳纤维微盘电极和铂微盘电极在几十秒钟就分离检测到了多巴胺、5 羟色胺和肾上腺素等神经递质,而且多巴胺的检测限达到了5.5×10-7ｍｏｌ/Ｌ,该芯片系统的一个突出特点是微电极不直接制作在微芯片上,可以根据实验的需要,简便地更换各种微电极和修饰电极。

1.2　电导型电化学传感器

电导型电化学传感器是一种建立在双电层理论上的传感技术,物质的吸附和表面电荷的改变对双电层结构都会产生明显影响。当两电极放置在电解质溶液中,电极-溶液界面的行为可近似认为是一个平行板电容器,在两个电极上加上一定电压时,溶液中的离子在电场作用下发生迁移,从而产生电流,而此电流的大小与溶液的电导率成正比,电导率与离子浓度、离子所带电荷、温度等因素有关,当离子电荷和温度等参数恒定时,通过检测溶液的电导率,可以实现对离子浓度的测定。为了避免电极双电层充电,以及其它与直流电流有关现象的产生,通常采用交流电源测量溶液的电导。从原理上讲,电导型电化学传感器应该是最灵敏的电化学检测方法,但由于溶液中电导的测量不是特异性的,通常溶液中都会有其它的离子存在,从而产生很高的背景信号,这就决定了电导型电化学传感器更多是适用于对迁移速度快的无机离子和某些有机物质进行分析。

Ｇｒａβ等人首先用热压印法在一块聚甲基丙烯酸甲酯(ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔ,ＰＭＭＡ)材料上压印出电泳沟道,然后利用溅射沉积技术在另一块ＰＭＭＡ上制作了Ｐｔ电极,芯片采用等速电泳(ｉｓｏｔａ ｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ,ＩＴＰ)分离模式,对乳酸、草酸等7种有机酸进行了分离检测,由于选用的基底材料是价格低廉、制作成本低的有机聚合物,该芯片非常适合于一次性使用。当电导检测电极直接与待测溶液接触时,很容易污染电极,形成气泡,同时也限制了灵活设计电泳沟道和有效隔离高压电场,近来的电导检测更多的是采用非接触式电导检测模式,Ｐｕｍｅｒａ等人同样以ＰＭＭＡ作为芯片材料,铝薄膜电极作为电导检测电极制作在芯片的上下两面,这样可避免与溶液直接接触,此时的铝薄膜电极就相当于一个平行板电容器,直接对电泳沟道中溶液阻抗的变化进行响应,这从根本上克服了电极被污染的问题,同时也简化了电极的制作工艺,用该芯片成功地完成了对Ｋ+,Ｃｌ-等无机阴、阳离子的分离检测,其响应的线性范围是2.0×10-5～7.0×10-3ｍｏｌ/Ｌ,Ｋ+,Ｃｌ-的检测限分别达到了2.8×10-6ｍｏｌ/Ｌ和6.4×10-6ｍｏｌ/Ｌ。

1.3　电位型电化学传感器

电位型电化学传感器主要是指离子选择性电极,其核心部件是传感器的离子选择性敏感膜,敏感膜把待测溶液和电极内充液分隔开,它能对溶液中被测离子进行选择性响应,从而引起膜电位的变化,当达到平衡时,膜电位的变化与被测离子活度的关系符合能斯特(Ｎｅｒｎｓｔ)方程,即电位差与溶液中待测离子活度的对数在一定范围内呈线性关系,通过此关系可实现对待测物质的检测。在芯片实验室出现之前,已经有人把微型化的液膜离子选择性电极、ＰＶＣ膜离子选择性电极以及涂丝电极成功地用于毛细管电泳等流动体系的检测,但要想把它应用到微尺寸的芯片实验室上时,电极的机械强度和耐用性仍是一个挑战。ＰＶＣ膜电极、液膜电极等的敏感膜机械强度差,不适宜直接植入芯片实验室中,而固态化的离子敏场效应晶体管(ｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｆｉｅｌｄｅｆｆｅｃｔｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ,ＩＳＦＥＴ)由于易于集成化和微型化,目前已成为研究的热点。Ｏｋｉ等人[10]在石英基底上制作了一种测定人体血液中Ｈ+,Ｋ+和Ｎａ+等健康指标的医用微芯片,他们在芯片的毛细管中植入了Ｈ+,Ｋ+和Ｎａ+离子敏等三种ＦＥＴ,当血样通过下游电渗泵驱动流经ＩＳＦＥＴ时,三种传感器分别对Ｈ+,Ｋ+和Ｎａ+浓度进行快速响应和检测,该芯片分析速度快、试剂消耗少,非常适合临床监测。

Ａｒｑｕｉｎｔ等人在尺寸为6ｍｍ×22ｍｍ的硅芯片上研制了一台血气分析仪,他们利用标准的微加工技术在硅基底上制作了供ｐＣＯ2,ｐＨ检测的电位型传感器和供ｐＯ2检测的电流型传感器,由于整个芯片的制作过程采用的是成熟的集成电路工艺,所以芯片的生产成本显著降低、各芯片的一致性大大提高,该芯片各项检测指标都达到了临床应用的要求。为了克服了传统ＰＶＣ离子选择性电极机械强度差和不易集成的缺点,Ｔａｎｔｒａ等人首次报道了一种新型的Ｂａ2+离子敏玻璃芯片,他们依据传统ＰＶＣ离子选择性电极的结构原理利用微加工技术在玻璃基底上刻蚀出供存储Ｂａ2+敏ＰＶＣ溶液的Ｕ型沟道和供样品流通的直型沟道,参比电极直接放置在样品流通沟道的出口处,与通常离子选择性电极不同,该芯片实验室采用的是流动注射(ｆｌｏｗｉｎ ｊｅｃｔｉｏｎ,ＦＩ)进样,可对样品进行连续监测,这样大大简化了操作步骤、缩短了分析时间,从而实现Ｂａ2+样品检测的连续化。用该芯片获得的Ｂａ2+检测限为1×10-6ｍｏｌ/Ｌ,检测范围是1×10-1～1×10-6ｍｏｌ/Ｌ,其性能参数与相应的液膜电极或ＰＶＣ膜电极一致。

2　结束语

芯片实验室的研究目前已经成为生化分析领域的前沿和热点,因为它从根本上改变了传统生化分析的方式和效率,它将具有广阔的应用前景和极富潜力的应用价值。随着芯片实验室制作技术的不断成熟和各种新型材料的不断开发,芯片实验室将更为集成化和微型化,而电化学传感器易于集成化和微型化的特点,顺应了未来芯片实验室发展的方向。无疑,它将成为芯片实验室技术一个非常具有生命力的科学前沿。可以预见,在不久的将来,基于电化学检测的芯片实验室必将在医学诊断、环境监测、司法鉴定等领域占有一席之地,并为真正意义上的芯片实验室的市场化打下坚实的基础。